All Natural

Número 0
Tema: Ingeniería Genética

¿Quienes somos?


<< Volver a inicio

- Alimentos transgénicos
- Uso de alimentos transgénicos
- Riesgos para la salud
- Experimentación con animales
- Cuestiones de opinión
- Problemas económicos
- Mitos sobre la ingenieria genética

6. Reflexiones bioéticas

7. Derechos del consumidor: Etiquetado

8. Legislación

Técnicas de manipulación

A pesar de que no es fácil la clasificación, hemos creído conveniente dividir el modo de introducción en dos tipos: los directos y los que utilizan determinados vehículos (sistemas indirectos).

2.1- Métodos directos

SISTEMAS QUÍMICOS
Transferencia con fosfato de calcio
Se empezó a usar esta técnica en los años 60, pero fue en los 70 cuando se empezó a desarrollar suficientemente para tener buenas eficacias de transfección. Se basa en la precipitación del DNA exógeno y los iones de calcio, provocando que la célula, mediante endocitosis, introduzca el DNA en su interior. La eficacia de transfección puede llegar al 10% de las células, aunque suele ser transitoria.
No es una técnica que provoque toxicidad en las células pero la expresión del transgen es muy pequeña. Únicamente se usa en cultivos celulares, y por lo tanto su aplicación es "ex vivo".


SISTEMAS FÍSICOS
Microinyección
Consiste en colocar el DNA mediante una inyección en el núcleo de las células. Al introducirlo directamente allí, evitamos la degradación citoplasmática y lisosomal. Se realiza mediante un micromanipulador, microscopio invertido que permite la visualización.
Las células que sobreviven y han insertado el material genético presentan una alta eficacia de expresión del mismo. La técnica es muy laboriosa y necesita células aisladas para su realización. Este sistema se suele utilizar "ex vivo". En el caso de inyección en embriones se denomina terapia génica germinal siendo un método "in vivo".


Electroporación
Se introduce la construcción génica mediante un choque eléctrico a las células que provoca la formación de poros en sus membranas , por donde entra el transgén. Está especialmente indicado para células con una alta tasa de proliferación. Sin embargo, muchas células mueren al no soportar el choque eléctrico por lo que muchas veces no es la forma más indicada en algunos tipos celulares.

DNA desnudo
Consiste en la introducción del DNA en una solución salina o sérica, normalmente mediante inyección intramuscular, para conseguir la expresión del transgén. Se ha observado actualmente expresión en timo, piel, músculo cardíaco y músculo esquelético. No se conoce el mecanismo por el que llega a entrar a la célula aunque se postula que es a través del complejo del poro nuclear.
Tiene un bajo porcentaje de células transfectadas, no hay integración en el genoma y una vez inyectado no hay replicación en el genoma. Este es un sistema utilizado para la realización de la terapia génica "in vivo".

2.2- Métodos indirectos (mediados por vectores)

VECTORES NO VIRALES
Liposomas
En 1965 se descubrió que los liposomas (bolsas rodeadas de una membrana lipídica a semejanza de una célula eucariota animal) eran capaces de hacer entrar DNA en la célula, pero hasta 1980 no se consiguió una eficacia de transfección adecuada. Existen dos tipos de liposomas: liposomas catiónicos y liposomas aniónicos.

Liposomas catiónicos
Se encuentran cargados positivamente por lo que interaccionan con la carga negativa del DNA. Existen muchos lípidos que se usan para formar estos liposomas e incluso se están probando mezclas de estos. Son recomendables en transfecciones "in vitro".
Las ventajas de los liposomas es que protegen de la degradación al transgén hasta su llegada al núcleo. La talla del DNA introducido en ellos no tiene límite. Podemos hacerlos llegar a tejidos específicos incluyendo receptores en la capa lipídica.
Sin embargo como desventaja presentan la baja eficacia de transfeción, una expresión transitoria, cierto grado de toxicidad celular y pueden ser inhibidos por componentes séricos.

Biolística o Gene-gun
Consiste en el bombardeo de los tejidos con partículas de oro o tungsteno que llevan adheridas a ellas el DNA. El bombardeo se realiza mediante una descarga con helio como si fuera una pistola (de allí el nombre de la técnica).
La capacidad de penetración es limitada usándose en líneas celulares, epidermis, músculo e hígado. Su expresión es transitoria y en la zona de descarga se produce una gran muerte celular. Esta técnica puede realizarse "ex vivo" (en el caso de células animales) e "in vivo" (en el caso de células vegetales).

Vectores virales
Esta metodología comienza en 1968 cuando se demuestra que los virus son capaces de infectar células de mamífero. El desarrollo en 1989 de las células empaquetadoras (aportan la composición proteica que necesitan los virus para su funcionalidad ya que ésta ha sido eliminada del genoma viral) supuso un avance importante en esta metodología al aumentar la titulación en virus no patógenos. En todos los casos vamos a eliminar el mayor número de genes y secuencias al virus para que pueda captar el DNA exógeno. Los vectores virales pueden ser utilizados tanto "in vivo" como "ex vivo". Hasta el momento los virus más utilizados en terapia génica son los siguientes:

- Retrovirus
Son virus ARN que tienen capacidad para integrar genes terapéuticos relativamente grandes (un máximo de 8 Kb). Necesitan de células empaquetadoras para su obtención. Se transfiere el DNA del virus mediante la técnica del fosfato de calcio a las células empaquetadoras. Posteriormente se realiza una segunda transducción en la cual introducimos la construcción génica de interés.
Los virus inyectados en el huésped integran su DNA en el genoma del huésped expresando así el gen que le hemos añadido. Como las proteínas del virus no son expresadas por el huésped, no tenemos una respuesta inmunitaria. Tienen una alta eficacia de transducción y también de expresión, siendo un sistema bien estudiado.
Sin embargo, únicamente sirven para infectar células del huésped que se encuentran en división. Además los títulos de virus obtenidos hasta ahora son bajos y la integración en el genoma es al azar.
Existen también vectores basados en el virus del SIDA (HIV), cuyo genoma es más complejo pero con un funcionamiento similar al que hemos visto. Son los denominados lentivirus.

- Adenovirus
Son una familia de virus ADN que causan infecciones en el tracto respiratorio humano. Se pueden llegar a insertar en ellos hasta 7.5 Kb. de DNA exógeno. Normalmente en terapia génica se utiliza el serotipo 5, aunque existen hasta 42 serotipos diferentes que infectan a humanos.
En este caso no se necesita la integración del material hereditario del virus en el del huésped para su replicación, por lo tanto tampoco el transgén será introducido en el genoma de la célula. Y por tanto tampoco necesitan que las células infectadas estén dividiéndose para su replicación.
La gran ventaja de usar un adenovirus como vector es la alta eficacia de transducción, al igual que la expresión de la construcción génica introducida, sin embargo ésta es transitoria (pocas semanas). Esto último obligaría a tratamientos periódicos lo cual es un inconveniente ya que los adenovirus producen respuesta inmune celular e inflamatoria.

- Virus adenoasociados (VAA)
Son parvovirus, contienen DNA como material genético, y requieren la coinfección con un adenovirus para multiplicarse. Son vectores que combinan las ventajas de los retrovirales y los adenovirales. Su capacidad de integrar DNA exógeno es pequeña, sólo de 5 Kb.
Las principales ventajas son que los virus adenoasociados integran su DNA en la célula durante la replicación, por lo que la transducción (la cual es altamente eficaz) es estable en la célula diana. Además pueden infectar tanto a células en división como a las que no lo están (de gran importancia para la terapia génica "in vivo"). Los vectores AAV no están implicados en ningún tipo de enfermedad humana. Además el riesgo de una respuesta inmune está minimizado ya que no produce proteínas víricas.
Sin embargo existen también una serie de inconvenientes como que este tipo de vectores todavía no ha sido tan bien estudiado como los retrovirus y los adenovirus.

- Herpesvirus
Son virus DNA cuyas células diana son las neuronas. Su complejidad y lo poco que todavía conocemos de esta familia de virus dificulta su utilización.
La gran ventaja es el gran tamaño de su DNA , que les permite aceptar varios genes terapéuticos, incluso podrían ir con sus propias regiones reguladoras.
Uno de los inconvenientes es que habría que eliminar las secuencias que codifican para las proteínas líticas del virus que causan la muerte de las células a las que infectan.

Como resumen de los vectores, podemos hacer una recopilación de las características que deberían presentar para obtener el vector ideal para su uso en terapia génica:
- Permitir la incorporación y expresión regulada durante el tiempo conveniente, de uno o más genes necesarios para la aplicación clínica requerida.
- Ser específico en su transferencia génica.
- Ser irreconocible para el sistema inmune y no inducir respuesta inflamatoria.
- Ser estable y fácil de obtener.