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Tema: Ingeniería Genética

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6. Reflexiones bioéticas

7. Derechos del consumidor: Etiquetado

8. Legislación

Técnicas de manipulación genética

En este punto se profundizará el conocimiento sobre los métodos de manipulación génica. El fin con el cual se realizan dichas manipulaciones se tratará más adelante, cuando se analicen los alcances de esta ciencia.

Algunas de las fases y sustancias indispensables para la realización de técnicas de ingeniería genética son las siguientes:


Enzimas de restricción.
La IG consiste la manipulación del ADN. En este proceso son muy importantes las llamadas enzimas de restricción, producidas por varias bacterias.

Estas enzimas tienen la capacidad de reconocer una secuencia determinada de nucleótidos y extraerla del resto de la cadena. Esta secuencia, que se denomina Restriction Fragment Lenght Polymophism o RLPM, puede volver a colocarse con la ayuda de otra clase de enzimas, las ligasas. Análogamente, la enzima de restricción se convierte en una "tijera de ADN", y la ligasa en el "pegamento". Por lo tanto, es posible quitar un gen de la cadena principal y en su lugar colocar otro.

Vectores.
En el proceso de manipulación también son importantes los vectores: partes de ADN que se pueden autorreplicar con independencia del ADN de la célula huésped donde crecen. Estos vectores permiten obtener múltiples copias de un trozo específico de ADN, lo que proporciona una gran cantidad de material fiable con el que trabajar. El proceso de transformación de una porción de ADN en un vector se denomina clonación. Pero el concepto de clonación que "circula" y está en boca de todos es más amplio: se trata de "fabricar", por medios naturales o artificiales, individuos genéticamente idénticos.

ADN polimerasa.
Otro método para la producción de réplicas de ADN descubierto recientemente es el de la utilización de la enzima polimerasa. Éste método, que consiste en una verdadera reacción en cadena, es más rápido, fácil de realizar y económico que la técnica de vectores.

Y es imprescindible el conocimiento de los fundamentos básicos de la recombinación del ADN:

FUNDAMENTOS DE LA RECOMBINACION DEL ADN

Todos los seres vivos están hechos de células que están programadas con el mismo material genético básico, el ácido desoxiribonucléico (ADN). Cada unidad de ADN está hecha de nucleotidos: adenina (A), guanina (G), timina (T) y citosina (C), así como un azúcar (deoxiribosa) y un grupo fosfato.

Los nucleotidos se aparean (A) con (T), (G) con (C) en una cadena antiparalela en espiral, denominada la doble hélice de material genético. En donde cada célula de un organismo individual tiene las mismas unidades de ADN conteniendo la información total del individuo y de las funciones diferenciadas de las células.


Cuando las células se reproducen, las hebras de ADN de la doble hélice se separan. A causa de que el nucleótido (A) se aparea con un doble enlace con (T) y (G) se aparea con un triple enlace con (C), cada hebra de ADN sirve como una precisa copia fiel para la otra. Excepto por las mutaciones o pérdidas en los procesos de reproducción, cada célula está equipada con la información para replicarse en millones de células idénticas.

Las Secuencias Reguladoras de Consenso o Canónicas, son secuencias de nucleótidos que realizan su función reguladora adyacente e internamente en el gen, tales como las secuencias operadoras que son el punto de unión de las proteínas represoras. O cerca o adyacentes al gen, como las secuencias promotoras, tal es el caso de la caja Pribnow a -10 pares de base (pb) del gen, o de otros promotores a -35 o -50 pb en genes procariónicos y la caja TATA o Goldberg- Hogness a - 25 o -40 pb en genes eucariónicos.


Adicionalmente, se han encontrado en eucariones, cientos de sitios que estimulan la transcripción por ARN polimerasa II. La secuencia única altamente conservada para ARN pol II es la caja TATA. Los análisis en más de 150 genes clonados de animales y plantas han mostrado que las secuencias CCAAT y GGGCG están presentes en 10 a 15% de los genes, usualmente entre -60 a -120 pb y se conocen como secuencias realzadoras. Las secuen-cias realzadoras pueden estar cerca, lejos, corriente arriba o corriente abajo del gen, o al interior del gen, realzando la actividad de transcripción de 5´ a 3´ o de 3´ a 5´.

TECNICAS BASICAS DE LA BIOLOGIA MOLECULAR
Dado que todas las cosas vivas están hechas del mismo tipo de material genético, (ADN) los biotecnólogos usan enzimas de restricción tipo II (descubiertas en 1968 por O. H. Smith y otros) para cortar secuencias específicas, y remover información genética individual de un organismo. Las enzimas de restric-ción han sido aisladas de más de 230 cepas bacterianas y hay más de 91 sitios especí-ficos diferentes de corte.

Los cortes pueden ser romos (Alu I) AG*CT TC*GA

o cohesivos (Eco RY 13) G*AATTC CTTAA*G

Los fragmentos de restricción de ADN, generados al ser cortados por enzimas de restricción, pueden ser facilmente separados por gel electroforésis. C. Aaij & B. P. Borst, 1972, demostraron que se pueden separar en geles de agarosa moléculas de diferente peso molecular. En donde la velocidad de separación de los fragmentos está en función de su longitud, y los fragmentos más pequeños se mueven mucho más rápido que los fragmentos largos.

Para evaluar la presencia de ácidos nucléicos estos se marcan con moléculas fluorescentes antes o después de la electroforésis. El Bromuro de Etidio es usado para este propósito, que puede ser visualizado con luz U.V. a una longitud de onda de 302 nanometros (nm). A 366 nm hay deficiente fluorescencia y a 254 nm hay considerable cantidad de cortes, dimerización y destinción del complejo ADN-BrEt.

Los segmentos de ADN separados se pueden unir con otros segmentos de ADN por medio de las enzimas ligasas. Generalmente se usan tres tipos:
1) la ADN ligasa de E. coli que une cortes cohesivos,

2) la ADN ligasa T4 une puntas romas,

3) la Deoxinucleotidil Transferasa Terminal de Timo de Ternero (TTTTD) que sintetiza copias homopoliméricas 3´ de hebra simple en finales producidos por una lambda exonucleasa.

E. M. Southern (1975) demostró que fragmentos de ADN separados por gel electroforesis podían ser transferidos por capilaridad a papel de nitrocelulosa inmovilizandolo en el papel. A la técnica se le conoce como Southern blot. El filtro de nitrocelulosa se coloca directamente sobre el gel, el ADN es desnaturalizado (se separa en copia única) y es neutralizado y transferido por capila-ridad en un amortiguador de alta concentración de sal. El ADN desnaturalizado se mantiene permanentemente adherido al filtro al hornear este a 80°C por dos horas. El ADN transferido puede ser usado para reacciones de hibridación.

La reacción de Nick Translation (corte y cambio) es usada para introducir nucleótidos fosfato radioactivos (calientes) o no radioactivos (fríos) al interior del ADN sin marcar, con el propósito de hacer una sonda. La reacción depende de la habilidad de la enzima ADN polimerasa I para iniciar la síntesis de ADN en los grupos OH libres 3´, los cuales son expuestos como "Nicks" cortes en una hebra en el ADN no marcado. Los nick son generados en localizaciones al azar por una digestión limitada del ADN por la ADNasa I. La polimerasa I sintetiza nuevo ADN en la dirección 5´ a 3´ usando nucleótidos trifosfatos marcados radioactivamente o enzimáticamente.


Para transplantar el ADN y recombinarlo con el material genético de otro organismo se usan los vectores de clonación. Los conocidos como vectores primarios de clonación son unidades de ADN autónomamente replicativas en las cuales son colocados fragmentos de restricción de ADN foráneo para su clonación:

1) PLASMIDOS de 10 a 20 kilo bases pares (kb) y clonan como máximo 10 kb,

2) FAGOS de 25 a 55 kb y clonan como máximo 10 a 20 kb, y

3) COSMIDOS de 55 kb y clonan como máximo 35 a 50 kb.

La Reacción en Cadena de Polimerización (PCR) inventado por Kary Mullis (1987) es un método in vitro de síntesis de ADN, por una ADN polimerasa termoes-table (por ejemplo la Taq polimerasa), por la cual un segmento particular de ADN puede ser replicado espe-cíficamente. Esto involucra dos oligonucleótidos "Primers" (segmentos pequeños de ARN) que se sitúan a los lados del fragmento de ADN que va a ser simplifi-cado y ciclos repetidos de desnaturalización por calor del ADN; alineamiento de los Primers a sus secuencias complementarias, y extensión de los Primers alineados con ADN polimerasa termoestable. Estos Primers hibri-dizan a hebras opuestas de las secuencias blanco y son orientados de tal manera que la síntesis de ADN por la polimerasa termoestable procede a colocar nucleótidos complementarios hacia la punta opuesta del Primer, sintetizando la hebra complementaria de ADN.
Por lo que cada ciclo de desnaturalización, alineación de los Primers y polimerización, dobla la cantidad de ADN sintetizado en el ciclo previo. El resultado es una acumulación exponencial (2n) del fragmento inicial.